Влияние нагревания в микроволновой печи на усвояемость и клеточную микроструктуру сена

Влияние нагревания в микроволновой печи на усвояемость и клеточную микроструктуру сена.

Md Safiqur Rahaman Shishir, Graham Brodie, Brendan Cullen, Ravneet Kaur, Ellie Cho, Long Cheng

Applied Science, MDPI, ноябрь 2020 г.

 Аннотация: Чтобы исследовать влияние микроволновой (MW) обработки на питательную ценность пяти видов сена (50 г), их обрабатывали в MW в течение 0 (контроль), 20, 40, 60 и 80 с (0, 440, 880, 1320 и 1760 кДж кг−1 из MW энергии соответственно) и анализировали на пищевую ценность перед сканированием с помощью электронного микроскопа для наблюдения изменений микроструктуры.

Содержание сухого вещества (ДМ) в сене увеличивалось с увеличением времени обработки (р < 0,001). Повышение легкоусвояемого органического вещества были зарегистрированы у обработанной MW люцерны (60 с), пшеницы (40 с) и канолы (20 с) (р < 0,001), что могло быть связано с разрывом клеточной стенки. Энергия MW, необходимая для максимального улучшения усвояемости сена, была линейно связана с содержанием сырого протеина в контрольном сене (r2 = 0,79; р < 0,001).

Ключевые слова: термическая обработка; пищевая ценность; качество корма; SEM-IA; консервированный корм

1. Введение

Фуражное сено является основным консервируемым компонентом кормов, который используют во всем мире для кормления жвачных животных. Однако, высокая концентрация клеточных стенок в продуктах из сена может ограничить потребление жвачными животными и доступ микробиоте рубца к питательным веществам, именно поэтому это часто приводит к неоптимальной продуктивности жвачных животных (Chaudry and Miller 1996).

Ранее был изучен ряд физических, химических и биологических обработок для изучения влияния на переваримость сена [4]. Микроволновая обработка (MW) представляет собой неионизирующий метод электромагнитного физического нагрева, который доказал свою эффективность для повышения питательной ценности пищевых продуктов [5,6] благодаря своим безопасным, быстрым и энергоэффективным свойствам [7]. В пищевой промышленности MW-нагрев широко используется для размораживания замороженных продуктов, разогрева, предварительной варки, бланширования, выпечки, пастеризации и стерилизации пищевых продуктов [8]. Быстрое повышение внутренней температуры в обрабатываемом материале из-за нагрева, обычно известное как «тепловой путь», зачастую связано с диэлектрическими свойствами материала, которые могут вызвать разрушение клеточной стенки растения [9] и увеличить использование ранее недоступных клеточных питательных веществ [10].

Существует несколько исследований, в которых изучалось изменение питательной ценности концентрированных кормов (например, зерна) в зависимости от нагрева MW [11,12]. Эти исследования показали, что воздействие MW уменьшало способность рубца к разложению сухого вещества (DM) и повышало доступность обходного белка в тонком кишечнике, что потенциально могло положительно влиять на повышение продуктивности жвачных животных.

Brodie и соавт. [13] обнаружили, что обработка MW увеличила перевариваемость сухого вещества мелкомасштабной пепсин-целлюлазой in vitro (на 15%) сена люцерны по сравнению с контролем. Dong и соавт. [14] обнаружили аналогичное улучшение в обработанной MW пшеничной соломе при разложении органического вещества in sacco (на 20%) в исследованиях на яках по сравнению с контролем.

Основываясь на этих исследованиях, можно выдвинуть гипотезу, что обработка MВТ может повысить питательную ценность кормов для животных (зерно / грубые корма) независимо от различий в составе и структуре (например, высокое качество концентратов против низкокачественных грубых кормов, бобовые против не бобовых и т.д.) Однако информация, связанная с влиянием обработки MW на питательную ценность кормового сена и изучением потенциальных механизмов изменений, ограничена. Поэтому целью данного исследования было изучение влияния микроволновой термической обработки на питательную ценность кормового сена и микроструктуру клеток.

1. Материалы и методы

2.1. Экспериментальный проект в лаборатории «Дуки» Мельбурнского университета (Австралия) был проведен с пепсин-целлюлазой in vitro. Были отобраны пять различных видов кормового сена, обычно используемого для выращивания овец в южной Австралии. Кормовое сено подвергалось воздействию пяти различных уровней энергии MW троекратно.

2.2. Подготовка образцов и микроволновая обработка

Пять кормовых образцов состояли из люцерны (Medicago sativa) и канолы (Brassica napus), пастбищного (райграс многолетний; Lolium perenne. L + белый клевер; Trifolium repens), овсяного (Avena sativa) и пшеничного (Triticum aestivum) сена.

Все отобранные образцы сена были предварительно высушены естественной сушкой (DM колебалось в пределах 89% - 91%). Дальнейшее подсушивание не требовалась. Каждый из образцов был отобран из разных мест мешка или тюка сена, чтобы получить составную объемную пробу для обработки и анализа в MW.

Каждая обработка состояла из трех повторов (50 г/репликация) и была подвергнута обработке MW. Образцы сена обрабатывали в течение 0 (контроль), 20, 40, 60 или 80 с, что эквивалентно 0, 440, 880, 1320 и 1760 кДж кг−1 MW энергии, соответственно. Печь имела размер полости 370 мм × 380 мм × 210 мм, рабочую частоту 2,45 ГГц и номинальный уровень мощности 1,1 кВт.

На основании предэкспериментального теста было выбрано максимальное время обработки (80 с) в этом исследовании, поскольку это было самое близкое время для начала сжигания сена. Для достижения постоянной схемы обработки во всех обработанных образцах поворотный стол печи был помечен, чтобы свести к минимуму несоответствие обработки MW. Все обработанные образцы охлаждали при комнатной температуре в течение 3 ч  перед их измельчением через сито толщиной 1 мм в настольной ультрацентробежной настольной молотковой мельнице (RETSCH, ZM 200, Германия).

2.3. Химические анализы

Образцы обработанного MW сена анализировали на содержание сухого вещества и зольность. Количество органического вещества определяли расчётным методом. Сырой белок определяли с использованием метода Кьельдаля. Нейтральное-детергентную клетчатку (NDF) [16] и кислотно-детергентную клетчатку (ADF) [15] анализировали с использованием анализатора волокон ANKOM200 (фильтровальный мешок F57, ANKOM Technology, Fairport, НЬЮ-Йорк, США).

2.4. Усвояемость Пепсин-Целлюлазы In Vitro

Усвояемость пепсин-целлюлазы in vitro определяли в соответствии с описанием австралийского Руководства отраслевой ассоциации [17]. Использовали фермент пепсин из слизистой оболочки желудка свиньи от Sigma Aldrich Australia (Лиофилизированный порошок, ≥2500 ед/мг белка E1%/280). Использовали целлюлазу из Trichoderma viride (Япония).

2.5. Анализ изображений с помощью сканирующего Электронного микроскопа (SEM-IA)

Обработанное микроволновой печью сено было визуализировано с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM). Для анализа SEM использовали сено с наибольшим улучшением усвояемости (люцерна (60 с), рапс (20 с) и пшеничное сено (40 с) для сравнения с контролем. Сено канолы было исключено из-за его высокой хрупкости, что затрудняло подготовку репрезентативного образца для анализа. Изображения были получены для сена пшеницы и люцерны с их верхней поверхности и сердцевины. Затем визуализацию проводили на системе ThermoFisher Teneo в микроскопе Bio21 в Мельбурнском университете (Австралия). Далее изображения SEM были проанализированы для количественной оценки микроструктурных изменений каждого изображения с использованием программного обеспечения Fiji [18].

2.6. Статистический Анализ

Данные были проанализированы с использованием GenStat (Великобритания). Был проведен двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) химического состава и параметров усвояемости. Тест с наименьшей значимой разницей был использован для различения средних значений с 95%-ным уровнем достоверности. Была определена энергия MW, необходимая для различных кормов для достижения максимальной усвояемости сухого вещества. Затем был проведен линейный регрессионный анализ, чтобы установить взаимосвязь между базовыми параметрами питательных веществ из контрольного корма и исследуемых образцов.

1. Результаты

3.1. Химический состав сена, обработанного микроволновой печью

Питательная ценность контрольного корма, определенная в этом исследовании, находилась в пределах стандартного диапазона для сена.

Содержание сухого вещества в сене без обработки MW в этом исследовании составляло от 890 до 930 г/кг (в пересчете на натуральное вещество). В целом, содержание СВ в сене увеличивалось с увеличением времени обработки MW (Таблица 1). Однако не наблюдалось никакой разницы в содержании СВ при обработке MW в зависимости от типа корма (р = 0,197).

Аналогичным образом, разные сорта сена не показали различий в изменении СВ, NDF и ADF под воздействием MW (таблица 1). Однако эффект обработки MW увеличил содержание NDF в овсяном сене через 60 с после обработки (p = 0,026), а содержание ADF в рапсовом, пастбищном и пшеничном сене увеличилось (p < 0,001) через 80 с (таблица 1).

Сено, использованное в этом исследовании, имело СП в диапазоне от 70 до 181 г/кг без обработки MW (таблица 1). В изменении на СП наблюдалась значительное влияние (p = 0,007) при обработке MW при разном типе корма (Таблица 1). Обработка MW рапсового сена в течение 20 с и овсяного сена в течение 40 с увеличила СП по сравнению с контролем, но у других сортов сена не было различий в СП по сравнению с контролем (таблица 1).

3.2. Усвояемость Пепсин-Целлюлазы In Vitro

Усвояемость сухого вещества (DM) и усвояемость органического вещества в СВ (DOMD) в люцерновом, рапсовом и пшеничном сене увеличивалась при обработке MW в течение 60, 20 и 40 с (р < 0,001), соответственно, по сравнению с контрольной группой (таблица 1). С другой стороны, никаких изменений не было в СВ овса при 60-секундной обработке. При обработке же MW в течение 80 с показателя переваримости сена начали резко снижаться.

Таблица 1. Химический состав и переваримость (в пересчете на г/кг сухого вещества) сена, обработанного микроволновой обработкой (MW)

Показатели с разными надстрочными знаками (a, b, c или d...) значительно отличаются друг от друга из-за типа корма и взаимодействия между обработкой MW (FT×MT). Показатели с разными надстрочными знаками (A, B, C или D) значительно отличаются друг от друга в корме из-за обработки MW (MT). LSD - это наименее значимое показание разницы, которое указывает на статистическую  разницу между средними значениями с вероятностью 95%.

3.3. Анализ изображений с помощью сканирующего Электронного микроскопа (SEM-IA)

Наблюдение за контрольным образцом показало неповрежденную клеточную поверхностную  структуру. Напротив, образцы пшеницы и люцерны, обработанные MW, взятые как с верхней, так и из сердцевины, показали сильно разрушенные структуры и открытые участки (рисунки 1 и 2). Кроме того, интенсивность пикселей центрального образца из сердцевины люцернового сена, обработанного MW, показала самую высокую интенсивность (35,742), более низкая интенсивность была на поверхностных слоях (33,521) и у контроля (22,415). В случае пшеничного сена интенсивность пикселей для контроля, поверхности и сердцевины составили 8,335, 23,579 и 37,345 соответственно (рис. 2).

Рисунок 1. Изображения сена люцерны под сканирующим электронным микроскопом, (a, b) SEM и аналитическое изображение необработанного сена, соответственно. (c, d). Изображение дисперсии интенсивности, обработанное MW (взято сверху образца), соответственно, (e, f) обработанное MW (взято из сердцевины).

 Рисунок 2. Изображения сена пшеницы под сканирующим электронным микроскопом, (a, b) SEM и аналитическое изображение необработанного сена (c, d) SEM и изображение дисперсии интенсивности, обработанное MW (взято с верхней части образца) (e, f) Обработанное MW (взято из сердцевины образца).

3.4. Взаимосвязь между базовыми органическими питательными веществами и минимальной энергией MW, необходимой для максимального увеличение DMD%

Наблюдалась положительная взаимосвязь между содержанием СП в контрольном сене и максимальным увеличение DMD (например, исходное содержание СП в сене люцерны 181 г/кг увеличилось на 11%) из-за обработка MW (рис. 3а). Наблюдалась положительная взаимосвязь между минимально потребляемой энергией MW (MME) (кДж кг−1) и максимальным увеличением DMD%  (рисунок 3b).

Рисунок 3. Взаимосвязь между сырым протеином (CСП; г/кг) контрольного сена и изменениями DMD (%) из-за обработки MW (a) и минимальное потребление энергии MW (MME; кДж кг−1) для достижения максимальной усвояемости сухого вещества и СП г/кг (b).

В этом исследовании затраты MME на люцерну, рапс, овес, пастбищное сено и пшеницу составили 1320, 440, 0, 0 и 880 кДж кг−1 соответственно. Взаимосвязи между вводимым ММЕ и параметрами органических питательных веществ из контрольного корма показаны в таблице 2.

 Таблица 2. Соотношения между минимально потребляемой энергией MW (MME) для пяти испытанных кормовых образцов сена и показатели максимальной усвояемости сухого вещества и органических питательных веществ (сырого протеина и нейтральной детергентной клетчатки) из контрольного сена.

Уравнение было выведено на основе модели множественной линейной регрессии. M1 = СП: энергозатраты MW на сырой протеин; M2 = NDF: энергозатраты MW на нейтрально-детергентную клетчатку.

Наблюдалась умеренная взаимосвязь между содержанием NDF в контрольном образце и MME (Таблица 2) и сильная положительная линейная зависимость между содержанием СП в контрольном корме и MME (таблица 2). Однако не было обнаружено значимой (р = 0,688) взаимосвязи между ММЕ и MW.

1. Обсуждение

4.1. Химический состав

В целом, содержание СВ в этом исследовании постепенно увеличивалось с увеличением времени воздействия MW, что согласуется с предыдущими исследованиями [14,19]. Механизм нагрева, связанный с обработкой MW, способствовал образованию пара в клеточной стенке, что вызывало быстрый нагрев и, в конечном итоге, приводило к разрушению клеточной стенки, что приводило к быстрому испарению [20].

Принимая во внимание взаимодействие типа корма и обработки MW, было отмечено, что содержание СП в рапсовом и овсяном сене после 20-секундной и 40-секундной обработки MW увеличилось на 25% и 15% по сравнению с контролем, соответственно. Причины этого улучшения неизвестны, в то время как другие образцы сена не показали никаких изменений в содержании СП. Одна из возможных причин может быть связана с увеличением недоступного СП, связанного с клеточной стенкой, который может стать доступным как раз при разрушении клеточной стенки в этом исследовании (рисунки 1 и 2).

Кроме того, другие исследования кормов показали, что экзогенные белковые факторы (структура, содержание антипитательного фактора, крахмалистых и некрахмалистых полисахаридов) и эндогенные факторы (поперечные связи, молекулярная структура, гидрофобность) [22] могут быть изменены термической обработкой [23], что, в свою очередь, может повлиять на переваримость белка и доступность для животных [13]. Необходима дальнейшая работа, чтобы лучше понять, как и почему содержание СП изменяется при воздействии MW.

Большая часть предыдущих исследований была сосредоточена на обработке MW концентрированных кормов (зерна и шрота) и практически не сообщалось об изменении доли волокон в корме. В текущем исследовании содержание ADF и NDF в различных кормовых сортах сена не показало различий, когда рассматривалось взаимодействие обработки MW и типа корма. Кроме того, на содержание NDF и ADF в пшеничном сене не повлияла обработка MW. Этот результат согласуется с прежними опытами [14], в которых не обнаружилось различий в содержании ADF и NDF в пшеничной соломе, обработанной MW (750 Вт) в течение 240 с и 480 с.

4.2. Усвояемость сухого и органического вещества

На содержание СВ (DMD и DOMD) также было оказано воздействие обработкой MW, хотя эффект не был одинаковым для разных образцов сена в этом исследовании. Сено люцерны показало самый высокий прирост показателей DMD (11%) и DOMD (14%) при обработке 60 с MW по сравнению с контролем.

Уровень увеличения содержания МДД в сене люцерны был аналогичен результатам Brodie et al. (2012) [13]. Исследование показало, что МДД увеличился на 14,9% при обработке MW в течение 80 с (750 Вт) по сравнению с контролем. Броди и др. (2012) [13] предположили, что увеличение содержания DMD, возможно, было связано с разрушением микроструктуры клеток, что аналогично тому, что наблюдалось в текущем исследовании (рисунки 1 и 2).

Разрушение микроструктуры клеток в результате обработки MW может увеличить доступность питательных веществ и доступ к ним ферментов (например, перевариваемость СП).

Сено канолы показало увеличение содержания DMD и DOMD на 10% и 12% соответственно при 20-секундной обработке MW по сравнению с контролем. Пшеничное сено показало увеличение содержания DMD и DOMD на 5% и 8% при обработке 40 с MW по сравнению с контролем. Кроме того, ряд исследований концентрированных кормов (например, зерна, семян и шрота из семян) показали, что обработка MW повышает усвояемость концентрированных кормов [12,24,25]. Однако улучшение уровня переваримости в кормовом сене сравнительно ниже, чем в концентрированных кормах. Это может быть связано с различием в содержании питательных веществ, плотности и клеточной структуре [26].

4.3. Анализ изображений с помощью сканирующего электронного микроскопа

Наблюдение с помощью изображения SEM подтвердило, что целостность клеточных стенок была видна в клетках контрольного образца независимо от их высокой степени высушивания во время подготовки сена (рисунки 1 и 2).

На SEM-изображениях, обработанных MW, можно было увидеть обширное разрушение клеточной поверхности. Обработка MW может вызвать разрушение клеточных микроструктур и инициировать ослабление целостности [10].

Образец сердцевины керна показал большее разрушение, чем образец с поверхности, что, вероятно, связано с неравномерностью нагрева MW [27].

В настоящем исследовании более высокая дисперсия интенсивности в образце, обработанном MW, по сравнению с контролем указывает на то, что в клеточной микроструктуре сена люцерны и пшеницы могло произойти некоторое потенциальное разрушение (рисунки 1 и 2). Предыдущие исследования также подтвердили этот вывод. Например, Choi et al. (2006) [10] обнаружили, что из-за обработки MW в зерне сои происходило разрушение микроструктуры клеточной поверхности, что в итоге увеличивало извлечение растворимого соевого белка. В другом исследовании с рапсом также сообщалось о нарушении микроструктуры из-за обработки MW [29]. Однако важно отметить, что уровень разрушения микроструктуры в зерне и фуражном сене может быть неодинаковым, поскольку они отличаются друг от друга по морфологической и химической структуре.

4.4. Зависимость между минимальным потреблением микроволновой энергии и максимальным уровнем доступного сухого вещества в исследуемых образцах

Сено с более высоким содержанием СП, как правило, требует больше энергии для достижения максимального улучшения содержания DMD и оптимальной энергии MW в образце сена люцерны (1320 кДж кг−1). Предыдущие исследования также показали, что улучшение переваримости в значительной степени зависит от содержания СП в контрольном образце и его усвояемости [30]. Однако изменения с другими органическими веществами (например, ADF и NDF) были не такими сильными, как с содержанием СП в этом исследовании. Причина этой зависимости не известна. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять и подтвердить эту взаимосвязь. Важно отметить, что влияние нагрева MW на материал зависит от диэлектрических свойств [9], каждый биологический материал обладает разной степенью диэлектрических свойств, которые в конечном итоге влияют на распределение температуры в материале-мишени.

Реакции в любом нагретом материале зависят от распределения температуры, удержании и равновесии [31,32]. Эти механизмы регулируют вызванные нагревом изменения в любых материалах. Следовательно, изменения в составе питательных веществ и их усвояемости зависят от распределения температуры в сене. Необходимы дальнейшие исследования диэлектрических свойств фуражного сена, используемого в этом исследовании, чтобы понять взаимосвязь между основными параметрами питательной ценности (например, СП и СВ) и диэлектрическими свойствами материалов для того, чтобы лучше понять режим MW, необходимый для достижения максимального изменения питательных характеристик.

1. Выводы

Данное исследование подтвердило, что обработка MW может улучшить усвояемость СП и СВ люцерны, рапса и пшеничного сена. Кроме того, было также показано, что изменения в переваримости могут быть связаны с разрушением клеточной микроструктуры из-за обработки сена MW.

Основным выводом этого исследования является то, что есть взаимосвязь между исходным содержанием СП в сене, MМЕ и DMD, исходное содержание СП в сене может быть использовано для прогнозирования минимального расхода энергии MW, необходимого для максимального повышения питательности.

 Важно отметить, что фуражное сено обычно используется в качестве поддерживающего рациона для производства жвачных животных в периоды отсутствия свежего корма, но если качество сена можно улучшить, его можно использовать в качестве хорошего источника питательных веществ для составления рациона для жвачных животных. Хотя данные полученные, в результате этого исследования, можно оценивать как предварительные, все выявленные зависимости, можно считать достоверными и использовать как базу для дальнейшего изучения.

ССЫЛКИ

1. Wilson, J. Cell wall characteristics in relation to forage digestion by ruminants. J. Agric. Sci. 1994, 122, 173–182. [CrossRef]
2. Hoffman, P.C.; Shaver, R.D.; Combs, D.K.; Undersander, D.J.; Bauman, L.M.; Seeger, T.K. Understanding ndf digestibility of forages. Focus Forage Univ. Wis. Ext. 2001, 3, 10.
3. Harper, K.J.; McNeill, D.M. The role indf in the regulation of feed intake and the importance of its assessment in subtropical ruminant systems (the role of indf in the regulation of forage intake). Agriculture 2015, 5, 778–790. [CrossRef]
4. Sundstol, F.; Mgheni, D.; Pedersen, I. Recent findings on upgrading of the feeding value of straw by chemical and biological methods. In Proceedings of the International Conference on Increasing Livestock Production

through Utilization of Local Resources, Beijing, China, 18–22 October 1993; pp. 122–130.

1. Cross, G.A.; Fung, D.Y.; Decareau, R.V. The effect of microwaves on nutrient value of foods. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1982, 16, 355–381. [CrossRef] [PubMed]
2. Narimani, S.; Taghizadeh, A.; Sis, N.M.; Parnian, F.; Nobari, B.B. Effects of compound treatment of exogenous feed enzymes and microwave irradiation on in vitro ruminal fermentation and intestinal digestion of guar meal. Indian J. Anim. Sci. 2014, 84, 436–441.
3. Oliveira, M.; Franca, A. Microwave heating of foodstuffs. J. Food Eng. 2002, 53, 347–359. [CrossRef]
4. Kalla, A.M.; Devaraju, R. Microwave energy and its application in food industry: A reveiw. Asian J. Dairy Food Res. 2017, 36, 37–44. [CrossRef]
5. Brodie, G. Microwave heating in moist materials. In Advances in Induction and Microwave Heating of Mineral and Organic Materials; IntechOpen: London, UK, 2011.
6. Choi, I.; Choi, S.J.; Chun, J.K.; Moon, T.W. Extraction yield of soluble protein and microstructure of soybean affected by microwave heating. J. Food Process. Preserv. 2006, 30, 407–419. [CrossRef]
7. Sadeghi, A.; Shawrang, P. Effects of microwave irradiation on ruminal dry matter, protein and starch degradation characteristics of barley grain. Anim. Feed Sci. Technol. 2008, 141, 184–194. [CrossRef]
8. Ebrahimi, S.; Nikkhah, A.; Sadeghi, A. Changes in nutritive value and digestion kinetics of canola seed due to microwave irradiation. Asian Australas. J. Anim. Sci. 2010, 23, 347–354. [CrossRef]
9. Brodie, G.; Rath, C.; Devanny, M.; Reeve, J.; Lancaster, C.; Doherty, T.; Harris, G.; Chaplin, S.; Laird, C. The effect of microwave treatment on animal fodder. J. Microw. Power Electromagn. Energy 2012, 46, 57–67. [CrossRef] [PubMed]
10. Dong, S.; Long, R.; Zhang, D.; Hu, Z.; Pu, X. Effect of microwave treatment on chemical composition and in sacco digestibility of wheat straw in yak cow. Asian Australas. J. Anim. Sci. 2005, 18, 27–31. [CrossRef]
11. AOAC. Official Methods of Analysis of AOAC International. Volume i, Agricultural Chemicals, Contaminants, Drugs; Horwitz, W., Ed.; AOAC International: Gaithersburg, MD, USA, 2000.
12. Van Soest, P.J.; Robertson, J.B.; Lewis, B.A. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition. J. Dairy Sci. 1991, 74, 3583–3597. [CrossRef]
13. AFIA. Laboratory Methods Manual: A Reference Manual of Standard Methods for the Analysis of Fodder; Australian Fodder Industry Association Ltd.: Melbourne, Australia, 2011.
14. Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I.; Frise, E.; Kaynig, V.; Longair, M.; Pietzsch, T.; Preibisch, S.; Rueden, C.; Saalfeld, S.; Schmid, B.; et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. J. Nat. Methods 2012, 9, 676–682. [CrossRef] [PubMed]
15. Brodie, G.; Rath, C.; Devanny, M.; Reeve, J.; Lancaster, C.; Harris, G.; Chaplin, S.; Laird, C. Effect of microwave treatment on lucerne fodder. Anim. Prod. Sci. 2010, 50, 124–129. [CrossRef]
16. Brodie, G. Simultaneous heat and moisture diffusion during microwave heating of moist wood. Appl. Eng. Agric. 2007, 23, 179–187. [CrossRef]
17. Conklin-Brittain, N.L.; Dierenfeld, E.S.; Wrangham, R.W.; Norconk, M.; Silver, S. Chemical protein analysis: A comparison of kjeldahl crude protein and total ninhydrin protein from wild, tropical vegetation. J. Chem. Ecol. 1999, 25, 2601–2622.